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(2012)探秘野生动物的血涂片—爬行动物血液学

        在过去的几十年里,爬宠受到越来越多人的欢迎。异宠贸易数量增加和许多宠物店开始出售爬行动物可以明显地反映出这一趋势。这些动物售价低廉甚至是“一套全包”,然后被无知的宠物爱好者买走。他们常常随后立刻就意识到——这些爬行动物生病了,并越来越频繁地出现在兽医诊所中。 这当然为日常生活带来了一些可喜的变化,但是也给执业兽医医师带来了新的挑战。 爬行动物和其他常见哺乳动物的差异带来了一些困难:变温动物的生理学、它们对药物的反应、可行的实验室检测以及不同的血细胞形态学。

                         

                       图1: 自然栖息地中的绿鬣蜥

1、采血  

      采血方式取决于患病动物的种类(表1)。一些采血方法如断甲或尾尖采血已经过时,或者没有专业静脉穿刺的选择。  一般原则: 

  • 健康未脱水动物的安全采血量在其体重的0.5%-0.8%。
  •  血液的抗凝剂可以选择肝素锂,因为EDTA可能导致溶血,特别是对于龟类。 
  • 为了避免分析前的错误,如血细胞破坏或凝集,应立即制备血涂

  龟类/龟
  • 颈静脉
  • 背甲下静脉
  • 背侧或腹侧尾静脉
  •  (枕窦、股静脉和肱静脉)
    蜥蜴
  • 腹侧尾静脉
  • 腹部静脉
  • (臂神经丛)
       
  • 腹侧尾静脉?
  • (心脏)
  • (腭静脉)

                   表1: 爬行动物静脉穿刺部位

2、样本分析

       爬行动物和哺乳动物的血细胞有一些根本的区别:爬行动物的红细胞有细胞核,而哺乳动物只有白细胞和红细胞前体细胞有细胞核(图2)。                            

                             图2: 红细胞、血小板(中央)和淋巴细胞(右侧)

        通常,血细胞计数仪先进行红细胞和血小板的计数,然后裂解红细胞后对白细胞进行计数。不幸的是,爬行动物红细胞的细胞核和血小板无法裂解,因此无法准确可靠地区分不同的细胞系。因此自动细胞计数仪不适用于爬行动物的血样。 需要人工进行血细胞计数:

  • 方法之一是使用血球计,通过不同的染色和溶液体系进行计数(例如Unopette系统或Natt和Herrick’s染色)。这些方法需要较长时间,计数结果与自动化方法相比也有更高的变异性。 
  • 另一种人工计数方法是通过染色的血涂片进行白细胞和血小板的评估。这种方法的结果差异性也很大,但是快速简单,操作时需要一点经验。使用40×物镜(400×放大倍数,如有必要,可使用100×物镜/1000×放大倍数)对血涂片进行至少10个视野的白细胞计数。单个视野细胞计数的平均值乘以物镜放大倍数的平方(例如,400×放大则乘以1600,1000×放大则乘以10000)。其结果为每μl血液中的白细胞数量。
             计算示例:

                                      7 个白细胞/400x 视野
                                      7x1600=11200
                                      白细胞计数为11200/μl

  • 血小板可以使用相同的方法进行计数,使用100×物镜(1000×放大)但是结果乘以系数15000。
        此外,通过显微镜下观察获得白细胞分类计数和血细胞形态学检查结果。 

        无法评估红细胞数量。和哺乳动物一样,爬行动物的红细胞压积(PCV)可以通过微量血球容量计毛细管离心获得。血红蛋白浓度可以通过血细胞计数仪获得。

3、血细胞形态学


 
红细胞

        爬行动物的红细胞呈椭圆形,细胞中央可见细胞核。取决于不同染色方式,胞浆颜色呈橙色至粉红色或者淡紫色。在均质的胞浆中常含有圆形或者不规则形状的嗜碱性颗粒(图3)。观察到这种现象通常表示在制片、染色过程中造成的人为伪像或者干燥时间过长。轻微的红细胞大小不等和多染性在大多数爬行动物中是正常的。多染性红细胞(幼红细胞)增多可见于再生性贫血、蜕皮期和幼龄动物。

            
                    图3: 左:正常红细胞和血小板;右:干燥时间过长后的红细胞

在一些再生性贫血、炎症或冬眠后的病例中,可见红细胞前体细胞(图4)。和哺乳动物一样,这不一定是骨髓疾病的征象。

            

图4: 变色龙  发育不良的红细胞前体细胞(左)和一个分裂中的红细胞(右),伴有严重的炎症反应,病因为泄殖腔异物


血小板

        爬行动物血涂片中的血小板通常是聚集的,因此难以对它们进行计数。但是,如果出现血小板聚集(图5),其数量也可能是正常的。爬行动物血小板的形态多变,但是它们都是有核的,大多数都呈椭圆形(图5)。胞浆通常无色,也可能是淡蓝色或者淡紫色。如果血小板发生聚集(例如由于活化作用),则可能与小淋巴细胞混淆(图6)。

            

图5: 左:血小板聚集(赫曼陆龟);右:血小板的多种形态(上:鬃狮蜥;下:红尾蚺)


白细胞

       爬行动物的白细胞可分为异嗜性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和嗜天青粒细胞。由于不同物种以及同种不同亚种之间血细胞形态学的差异明显,有时会分类困难。白细胞分类计数结果自然会表现出较大的差异性,一方面,白细胞的数量会因季节、温度,一定程度上还受性别影响而不同,另一方面也会有种间差异。一些种类的爬行动物表现出淋巴细胞优势型血象,即淋巴细胞最多(例如鬃狮蜥、鬣蜥、陆龟),而在其他种类中则以粒细胞为主。

       淋巴细胞与哺乳动物类似,很容易与其他白细胞进行区分。它们的细胞核呈圆形,染色质深染,只有少量的嗜碱性细胞质。

           

                             图6: 左:小淋巴细胞;右:血小板
                         炎症和病毒感染时会出现淋巴细胞增多。

       异嗜性粒细胞的功能与哺乳动物的嗜中性粒细胞类似。异嗜性颗粒在快速染色中呈橙色至粉红色。有时这些颗粒发生溶解,导致胞浆呈嗜酸性(图7,左下)。异嗜颗粒和嗜酸性颗粒如果仅通过染色,有时难以区别。但是,异嗜性粒细胞通常更大,颗粒长,而嗜酸性颗粒几乎都是圆形的。

         

   图7: 异嗜性粒细胞:左上:红尾蚺;右上:黄腹彩龟;左下:缘翘陆龟;右下:绿鬣蜥

     一些动物的异嗜性粒细胞细胞核呈圆形(如龟、鳄鱼、蛇);其他种类(如鬣蜥、变色龙、巨蜥)成熟的异嗜性粒细胞细胞核会分叶。

            

               图8: 左:中毒性杆状异嗜性粒细胞;右:杆状核异嗜性粒细胞(绿鬣蜥)

       异嗜性粒细胞主要与炎症有关(常与单核细胞增多同时出现)。其他原因包括应激、副肿瘤性综合征或白血病(不常见)。在严重的急性炎症病例中,成熟异嗜性粒细胞核分叶的动物会表现出核左移(杆状)。在中毒性病变的极端病例中也可见到:生理性颗粒消失,细胞质呈嗜碱性和/或空泡化以及中毒性颗粒(图8)。

       大部分爬行动物的嗜酸性粒细胞含有鲜红色或橙色的圆形颗粒。一些物种(如绿鬣蜥、鬃狮蜥)嗜酸性粒细胞的颗粒也小而圆但是呈蓝色至灰色。嗜酸性粒细胞的数量在不同物种之间差异很大(变色龙通常嗜酸性粒细胞数量较多)并受很多因素影响,如季节和寄生虫感染(图9)。

            

                         图9: 嗜酸性粒细胞:左:红耳彩龟;右:鬣蜥

        嗜碱性粒细胞含有许多深紫色染色的颗粒,有时会使细胞中心的细胞核模糊不清。使用快速染色时嗜碱性粒细胞常显出较少的颗粒或表现出空泡化(图10)。      

             
                         图10: 嗜碱性粒细胞;右图中细胞无可见颗粒,胞浆内呈现空泡化

       单核细胞细胞核形态多变,和哺乳动物相似。这些细胞含有中等含量的蓝灰色细胞质,在活化的细胞中可见明显空泡。单核细胞增多症出现在许多炎性反应中,特别是肉芽肿性炎症反应(图11)。

              

图11:单核细胞:左:红耳彩龟;右:红尾蚺

        噬黑色素性巨噬细胞是低等脊椎动物体内一种特殊的单核细胞,会吞噬黑色素颗粒。这些细胞可见于炎性疾病中,尤其是在皮炎中(图12)。                             
图12: 噬黑色素性巨噬细胞,左图黑色素颗粒数量较少,右图患有严重皮炎的绿鬣蜥血液内可见细胞吞噬许多黑色素颗粒

       嗜天青粒细胞的起源是一个争议很大的话题。形态学上这些细胞类似单核细胞,细胞质中有许多粉尘样嗜酸性颗粒(图3)。许多作者将它们分为单核细胞的一个亚类。其他观察者则把这些细胞看作是一种单独的细胞类型。此外,嗜天青粒细胞的临床意义尚不明确。

              
                                            图13:高冠变色龙 嗜天青粒细胞